細(xì)胞裂解與蛋白質(zhì)定量

Solarbio提供的細(xì)胞裂解液：

本系列試劑隨同配送一支PMSF，請(qǐng)收到后-20℃保存。RIPA裂解液4℃保存，如發(fā)現(xiàn)有少量沉淀，可常溫放置半小時(shí)，沉淀可消失，不影響使用。

使用裂解液在提取核蛋白的同時(shí)，也會(huì)將基因組一并釋放出來(lái)，細(xì)胞量高時(shí)會(huì)造成細(xì)胞裂解液粘稠，此時(shí)可以直接加入蛋白上樣緩沖液，煮沸再離心，離心取上清直接上樣電泳；若想測(cè)定濃度，可入加少量SDS（1%），煮沸后離心測(cè)濃度。本系列蛋白提取試劑所提取的蛋白由于含有去污劑，所以不適合使用Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒，請(qǐng)選擇BCA法或者Lowry法檢測(cè)蛋白濃度。

       如果需要檢測(cè)和基因組結(jié)合特別緊密的蛋白，則可以通過超聲處理打碎打散粘稠狀物，隨后離心取上清用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

蛋白質(zhì)定量：

蛋白含量測(cè)定是以標(biāo)準(zhǔn)蛋白作為對(duì)照，根據(jù)蛋白濃度不同，吸光值不同而達(dá)到定量的目的。有些方法是理解蛋白本身的吸光值（紫外光譜吸收法）來(lái)定量，但更多的是用染料對(duì)蛋白進(jìn)行染色，利用染料與蛋白結(jié)合顯出與原染料及蛋白不同的吸光值來(lái)定量的。后一種方法應(yīng)用更普遍。

蛋白定量方法的選擇，應(yīng)該考慮到蛋白結(jié)構(gòu)（標(biāo)準(zhǔn)品選擇）、蛋白溶液內(nèi)干擾物等因素的影響。

考馬斯亮蘭G-250染料，在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合，使染料的大吸收峰的位置（lmax），由465nm變?yōu)?95nm，溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樘m色。經(jīng)研究認(rèn)為，染料主要是與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸（特別是精氨酸）和芳香族氨基酸殘基相結(jié)合。測(cè)定快速、簡(jiǎn)便，只需加一種試劑。完成一個(gè)樣品的測(cè)定，只需要5分鐘左右。由于染料與蛋白質(zhì)結(jié)合的過程，大約只要2分鐘即可完成，其顏色可以在1小時(shí)內(nèi)保持穩(wěn)定，且在5分鐘20分鐘之間，顏色的穩(wěn)定性好。由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白質(zhì)測(cè)定時(shí)有較大的偏差。去污劑、 Triton X-100、十二烷基硫酸鈉（SDS）干擾此法的測(cè)定。  

BCA（bicinchoninic acid）是理想的蛋白質(zhì)定量方法。該方法因快速靈敏、穩(wěn)定可靠，對(duì)不同種類蛋白質(zhì)檢測(cè)的變異系數(shù)非常小而倍備受專業(yè)人士的青睞。該方法的原理是，在堿性條件下，蛋白將Cu2+還原為Cu+，Cu+與BCA試劑形成紫色的絡(luò)合物，測(cè)定其在562nm處的吸收值，并與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比，即可計(jì)算待測(cè)蛋白的濃度。BCA法測(cè)定蛋白濃度不受絕大部分樣品中的化學(xué)物質(zhì)的影響。在組織細(xì)胞裂解實(shí)驗(yàn)中，低濃度的去垢劑SDS，Triton X-100，Tween不影響檢測(cè)結(jié)果，但螯合劑（EDTA，EGTA）、還原劑（DTT，巰基乙醇）和脂類會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果有一定影響。實(shí)驗(yàn)中，若發(fā)現(xiàn)樣品稀釋液或裂解液本身背景值較高，可試用Bradford法測(cè)定蛋白濃度。

Lowry法蛋白質(zhì)測(cè)定法是靈敏的方法之一。過去此法是應(yīng)用廣泛的一種方法，在堿性條件下，蛋白質(zhì)中的肽鍵與銅結(jié)合生成復(fù)合物。 Folin—酚試劑中的磷鉬酸鹽—磷鎢酸鹽被蛋白質(zhì)中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原，產(chǎn)生深蘭色（鉬蘭和鎢蘭的混合物）。在一定的條件下，蘭色深度與蛋白的量成正比。這個(gè)測(cè)定法的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高，缺點(diǎn)是費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)，要控制操作時(shí)間，標(biāo)準(zhǔn)曲線也不是嚴(yán)格的直線形式，且專一性較差，干擾物質(zhì)較多。